bio-ribo-seq-riboseq-preprocessing

Preprocess ribosome profiling data including adapter trimming, size selection, rRNA removal, and alignment. Use when preparing Ribo-seq reads for downstream analysis of translation.

1. Sprawdź wersje zainstalowanych narzędzi: cutadapt (4.4+), bowtie2 (2.5.3+), STAR (2.7.11+), samtools (1.19+) oraz bibliotek Python (numpy 1.26+, pysam 0.22+). Uruchom polecenia typu cutadapt --version i pip show cutadapt, aby potwierdzić zgodność. Jeśli wersje się różnią, sprawdź dokumentację każdego narzędzia, aby dostosować flagi poleceń.

2. Przygotuj plik FASTQ z surowymi odczytami Ribo-seq oraz sekwencję adaptera 3', którą chcesz usunąć. Uruchom cutadapt z flagami -a (sekwencja adaptera), -m (minimalna długość, np. 20 nt) i -M (maksymalna długość, np. 40 nt). Polecenie usunie adaptery i odfiltruje fragmenty poza oczekiwanym zakresem rozmiaru.

3. Zastosuj selekcję rozmiaru, aby zachować tylko reads odpowiadające fragmentom chronionym przez rybosomy (typowo 28–32 nt). Użyj cutadapt z parametrami długości lub dedykowanego narzędzia do filtrowania, aby wybrać dokładny zakres nukleotydów dla Twojego eksperymentu.

4. Usuń zanieczyszczenie rRNA, wyrównując reads do bazy danych sekwencji rRNA za pomocą bowtie2. Reads, które wyrównają się do rRNA, odfiltruj; pozostałe reads przejdą do następnego kroku. Upewnij się, że masz zbudowany indeks bowtie2 dla bazy rRNA.

5. Wyrównaj pozostałe reads do transkryptomu lub genomu za pomocą STAR. Skonfiguruj STAR z odpowiednimi parametrami dla Ribo-seq (np. długość read-ów, liczba mismatchy) i wygeneruj plik BAM z wyrównaniami.

6. Przefiltruj wynik, aby zachować tylko reads o wysokiej jakości wyrównania, używając samtools. Posortuj i zaindeksuj ostateczny plik BAM, który będzie gotowy do analizy translacji w narzędziach takich jak Riboseq lub RiboTish.